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北京智鼠多宝生物科技有限责任公司
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参苓散对脾阴虚痴呆模型大鼠海马区 BDNF、NGF 表达的影响

侯永春 严 孜1 ( 江西中医药大学,江西 南昌 330004)

    目的    观察参苓散对脾阴虚痴呆( AD) 大鼠海马区脑源性神经营养因子( BDNF) 、神经生长因子( NGF) 表达的影响。方法      48 只体重( 300 ± 20) g 的健康雄性大鼠,随机分成空白组( 空白对照) 、阴虚组( 脾阴虚) 、AD 组( 脾阴虚 + AD) 和 组( 脾阴虚 + AD ) ,每组 12 只。通过病证结合的方法建立脾阴虚 AD 大鼠模型,组给予中药参苓散灌胃,每日1 ml /100 g,持续10 d,其他各组每日予等体积生理盐水灌胃。采用Morris 水迷宫测试各组大鼠学习记忆能力,用疫组化( SP) 方法观察大鼠海马区BDNF 和NGF 的表达。结果     ①  造模后,阴虚组、AD 组、 组与空白组对比逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数减少( P 0. 05 P 0. 01) ; 给予参苓散后,组与阴虚组、AD 组相比,大鼠逃避潜伏期明显缩短,穿越平台次数增多( P 0. 01) ; ②与空白组比较,阴虚组、AD 组大鼠海马 BDNF、NGF 表达明显下调( P 0. 01) ; 而组大鼠海马 BDNF、NGF 表达与阴虚组、AD 组比较明显上调( P 0. 01) 。结论 参苓散能改善脾阴虚 AD 模型大鼠的学习记忆能力,增加其海马区 BDNF、NGF 表达。

关键词 参苓散; 痴呆; 脑源性神经营养因子; 神经生长因子

中图分类号 749 文献标识码 A 文章编号 1005-9202( 2014) 03-0728-03; doi: 10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2014. 03. 075

老年性痴呆( AD) 是一种枢神经系统退行性**,其进行性的认知功能障碍学习和记忆能力减退1。中医发现这一病症与脾虚湿胜、脑窍失养症状相似; 同时临床上也多用补脾益肾增智的方剂。参苓散具有益心力,除谬忘,能饮食,延年益寿的功效。近几年来发现大脑海马区神经因子数量减少和功能障碍在脾阴虚 AD 发生与发展中起到越来越重要的作用2。本研究观察参苓散对脾阴虚 AD 大鼠的学习记忆功能的改善作用,用疫组化( SP) 方法观察大鼠海马神经因子表达的变化,为防治脾阴虚 AD 病提供科学证据。

1 材料与方法

1. 1

1. 1. 1 动物 选用清洁级健康雄性 SD 大鼠 48 只,江西中医学院实验动物中心提供,合格证号 2011-50,体重( 300 ± 20) g,环境温度( 25 ± 2) ℃ ,自然昼夜节律,颗粒饲料饲养,自由饮水。

1. 1. 2    药品与试剂    参苓散( 药包括茯苓、人参、甘草等份自配,常规水煎,药液含生药 3. 2 g / ml) 和伤阴药( 吴茱萸、附子等,常规水煎,药液含生药 1 g / ml) 江西南华制药有限公司;   钠注射液,江西科伦药业有限公司;   3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷( APES) ; 抗兔 SP 试剂盒,中性磷酸盐缓冲溶液( PBS) ; 二氨基联苯胺( DAB) 显色剂( 均为中杉金桥) 。

1. 1. 3 仪器    2135 型石蜡切片机( Leica,德国) ,展片、烤片机( 山东红旗仪器厂,中国) ,DT10K 型电子天平( 江苏常熟长青仪器仪表厂,中国) ,恒温箱兼培养箱( 上海医用恒温设备厂, 中国) ,BX-41 型显微照相仪( OLYMOUS,日本) ,DB001 型 Mor- ris 水迷宫( 北京智鼠多宝生物科技有限责任公司,中国) 。

1. 2 方法

1. 2. 1    动物分组    48 只健康雄性大鼠称重后,随机分成四组: 空白组( 空白对照) 、阴虚组( 脾阴虚) 、AD 组( 脾阴虚 + AD) 和组( 脾阴虚 + AD +) ,每组 12 只。

1 江西中西药大学科技学院

**作者: 侯永春( 1979-) ,,讲师,主要从事中药药理学研究。

1. 2. 2 动物模型复制及给药

1. 2. 2. 1 脾阴虚证模型 首先对阴虚组、AD 组和组大鼠参照经典的复合因素造模法3进行脾阴虚模型的建立,分为脾气虚和脾阴虚两个阶段。实验第 1  15 天为脾气虚阶段,大鼠单日自由游泳达到耐力极限,禁食饲料,喂甘兰( 30 g / 只) ; 双日予猪油脂灌服; 空白组正常喂养,予等量生理盐水灌服。第 16  24 天为脾阴虚阶段,在脾气虚的基础上每日增加伤阴药 1 ml /100 g ,连续灌服。而空白组大鼠仅予等体积生理盐水灌服。

1. 2. 2. 2 脾阴虚 + AD 模型 AD 组、组大鼠继续进行AD 模型4的建立, MILLIQ 水将 Aβ1 40稀释成 5 μg / μl,37℃ 孵育1 w,使其变为聚集状态备用。大鼠经腹腔注射2%    钠( 45 mg / kg) 麻醉后,固定到脑立体定位仪,常规备皮**,切开皮肤; 选择双侧海马为注射靶区,取前囟后 3. 5 mm , 中线旁 2. 0 m ,门齿钩平面低于耳间线平面 3. 3 mm 处钻开颅骨,暴露硬脑膜,微量注射器自脑表面缓慢垂直进针至硬脑膜下2. 5 mm,AD 各组每侧予以2 μl 淀粉样蛋白酶( Aβ1  40 ) 溶液缓慢注入,留针以保证溶液充分弥散,缓慢撤针,缝合切口,皮下注射抗生 防止感染; 空白组和阴虚组大鼠进行同样手术, 仅注入等体积 MILLIQ 水,术后继续喂养。

1. 2. 3 药干预 术后第 4 天对组大鼠给予中药参苓散灌胃,每日 1  ml /100  g,持续 10  d,而其余各组大鼠每日予等体积生理盐水灌胃。

1. 2. 4  Morris 水迷宫试验   采用 Morris 水迷宫测试各组大鼠造模前、造模后、后学习记忆能力; 具体方法参照 Morris 等5的方法,分别于 AD 造模术前、造模术后第 3 天及结束后评价各组大鼠逃避潜伏期、穿越平台的次数。

1. 2. 5  标本制备  各组大鼠在进行行为学测试结束后,立即以致死量 100 g / L 水合氯醛( 350 mg / kg) 腹腔麻醉后,仰卧位固定于手术台上,剪开胸腔,暴露心脏,从心尖插入灌注针至左心室,同时剪开右心耳,快速滴入 37℃ 生理盐水 300  ml,无血污后改为滴入固定液 4℃ 的多聚甲醛 400 ml。待大鼠尾巴完全僵直时迅速断头,取出海马组织,固定于 4% 多聚甲醛溶液中 12 24  h,进行脱水透明及石蜡包埋。冠状面连续切片,厚度约3  μm,用经多聚赖氨酸处理过的载玻片捞片,晾干后置于 60℃的烤箱中烘烤备用。

1. 2. 6 脑源性神经营养因子(  BDNF) 、神经生长因子(  NGF)  疫组化检测     采用 疫组化 SP 法检测 BDNF  NGF 的表达,严格按照试剂说明书操作要求进行检测。在海马区随机选择 8 个视野,用显微图像分析系统下的目镜,400 倍显微计数,计算阳性细胞数平均数。

1. 3  统计学方法   应用 SPSSV11. 5 软件进行分析,计量资料 x ± s 表示,组间两两比较采用多组定量资料的单因素方差分析 LSD 法。

2. 1 定位航行试验      造模前各组大鼠定位航行试验逃避潜伏期无统计学差异( P  0. 05) ,具有可比性; 造模后,阴虚组、AD 组、组与空白组对比逃避潜伏期明显延长( P  0. 05 或P  0. 01) 。给予中药参苓散灌胃后,与阴虚组、AD 组相比,组逃避潜伏期明显缩短( P  0. 05) 。见表 1。

 


 2. 2    空间探索试验     造模前各组大鼠空间探索试验穿越平台次数无统计学差异( P 0. 05) ,且有可比性。造模后,阴虚组、AD 组、组与空白组对比穿越平台次数明显减少( P 0. 01) ; 其中组、AD 组与阴虚组比较,穿越平台次数明显减少( P 0. 01) 。给予中药参苓散灌胃后,与阴虚组、AD 组相比,组穿越平台次数明显增加( P 0. 01) 。见表 2。


2. 3  各组大鼠 BDNF、NGF 表达情况   与空白组比较,阴虚组、AD 组大鼠海马 BDNF、NGF 表达明显下调( P  0. 01) ; 而组与阴虚组、AD 组比较明显上调( P  0. 01) 。见表 3、 1。



    3 

AD 呈逐年上升的趋势,至今还没有令人满意的方法, 中** AD 给人们提出了新思路。本研究结果表明参苓散灌服能够明显提高脾阴虚 AD 大鼠的学习和记忆能力,改善认知功能。

海马结构作为大脑边缘系统的重要组成部分,在学习和记 忆等上等神经活动中起关键作用,海马神经元损害可能是 AD 的重要病理基础之一。神经营养因子是一类对神经有特异性的蛋白质,BDNF 和 NGF 就是其中的代表。随着对其深入研究,人们发现它们具有明确的促进和维持神经细胞分化、生长 和存活作用,在改善认知功能方面也有重要作用6 8。但中药方参苓散能否促进慢性脑缺血大鼠 BNF 的表达,目前国内外未见报道。本研究结果提示参苓散能通过启动 BDNF 的表达加强脑缺血后的内源性修复过程,这可能是内服参苓散后机体 对脑进行?;ぷ饔玫囊恢只?span>。

AD   属中医学的“痴证”、“呆病”等范畴,中医学认为引起本病的基本原因是肝肾亏虚、气血不足、经脉失养、髓海不足。 而脾胃为后天化生之源,脾胃气健则先天肾气充实,髓海得养。 参苓散方中人参大补元气,以生中气,健脾益肺,以助运化,   智 ,以充髓海;   更有茯苓协助利水渗湿,调补脾阴,益心脾而宁心 神,炙甘草**补中,调和诸药,共奏健脾 神之功。

 

4 参考文献

1 官志忠,齐晓岚 . 阿尔茨海默病的分子发病机制及其研究进展

J.  中华病理学杂志,2008; 37( 1) : 11-5.

2 Tesseur I,Van Dorpe J,Spittaels K,et al. Expression of human apoli- poprotein E4 in neurons causes hyperphosphorylation of protein tau in the brains of transgenic mice〔J〕. Am J Pathol,2000; 156( 3) : 951-64.

3 王少华, ,耿美玉 . 阿尔茨海默病的炎症病理机制及糖类物

4 质的**作用J.  生理科学进展,2005; 36( 1) : 67-70.郝小燕, , , . 组分中药对 D-半乳糖联合1-40 致痴呆模型大鼠脑组织抗氧化能力的影响J.  时珍国医国药,2012; 23 ( 10) : 2516-7.

5 Morris ,garrud P,awlins JN,et al. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions〔J〕.  Nature,1982; 297( 5868) : 681-3.

6 Amino S,Itakura M,Ohnishi H,et al.  Nerve growth factor enhances neu- rotransmitter release from PC12 cells by increasing Ca( 2 + ) -responsible secretory vesicles through the activation of mitogen-activated protein ki- nase and  phosphatidylinositol 3-kinase〔J〕.   J  Biochem,2002; 131 ( 6 ) : 887-94.

7 Yang JT,Chang  CN,Lee  TH,et  al.   Effect  of  dexamethasone  on  the  ex- pression of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 messen- ger ribonucleic acids after forebrain ischemia in the rat〔J〕 Crit Care Med,2002; 30( 4) : 913-8.

8 Hall  J,Thomas  KL,Everitt  BJ. Rapid  and  selective  induction  of  BNDF

expression in  the  hippocampus  during  contextual  learing. Nat  Neurosci, 2000; 3( 6) : 533-5.

        〔2012-11-26 收稿 2013-02-12 修回

       ( 编辑 袁左鸣)

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