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北京智鼠多宝生物科技有限责任公司
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蜂毒明肽对阿尔茨海默病小鼠认知功能的影响


蜂毒明肽对阿尔茨海默病小鼠认知功能的影响


吕延成, 林茂, 王敏, 田炳欣, 王春梅

摘要 目的 观察蜂毒明肽对阿尔茨海默病( AD) 小鼠认知功能的影响。方法 10 周龄昆明种雌性小鼠 60 只,随机分成 6 组,每组 10 只,分别为正常对照组、假手术组、AD 模型组、蜂毒明肽低剂量组、蜂毒明肽中剂量组、蜂毒明肽高剂量组。正常对照组不做任何处理,假手术组小鼠侧脑室注射生理盐水。采用侧脑室注射 β-淀粉样肽25  35 ( β- amyloid protein,Aβ25  35 ) 法构建 AD 小鼠模型。造模 14  d 后,蜂毒明肽干预的各组小鼠分别腹腔注射不同剂量的蜂毒明肽,连续 5 d。Morris 水迷宫测试认知功能,**组化染色观察海马CA1 区Aβ25  35 的表达。结果 与正常对照组相比,蜂毒明肽各组和 AD 模型组小鼠逃避潜伏期时间较长,目标象限停留时间较短,穿越平台次数降低,海马 CA1 区 Aβ25  35 阳性表达增强( P 均  0 05) ,而假手术组无统计学差异( P  0. 05) 。蜂毒明肽中、高剂量组小鼠与 AD 模型组小鼠相比,前者逃避潜伏期有所缩短,目标象限停留时间增加,穿越平台次数有所增多,海马 CA1 区 Aβ25  35 阳性表达有所减低( P 均  0 05) 。结论

蜂毒明肽能提高 AD 小鼠认知功能,减少海马 CA1 Aβ25 35 的表达。

关键词 蜂毒明肽; 阿尔茨海默病; 认知功能; β-淀粉样蛋白; CA1 区,海马回

中图分类号: 749. 1 + 6 文献标识码: A 文章编号: 1674 8182( 2014) 06 0644 03

阿尔茨海默病( Alzheimer' s  disease,AD) 作为一种临床常见的神经系统退行性**,主要表现为认知功能障碍。由于 AD 起病缓慢、病程长、病因复杂,目前尚无良好的****和方法。蜂毒明肽( apamin) 是一种神经**,其作为蜂毒各组分中分子量*小的神经毒肽是蜂毒中重要的活性物质之一。研究认为,蜂毒明肽可提高正常鼠或海马损伤鼠模型的空间记忆能力 2,但对公认的 AD 动物模型的干预作用报道很少。本研究采用侧脑室注射β-淀粉样肽25  35 ( β- amyloid protein,25  35 )  构建 AD 小鼠模型,初步观察蜂毒明肽对 AD 小鼠模型认知功能的影响,探讨其作用机制,以期为 AD **寻找新的分子靶点提供实验依据。



1 材料与方法

1 1 材料 蜂毒明肽由厦门市英伟生物技术有限公司提供。10 周龄健康昆明种雌性小鼠60 只,SPF 级,体重 ( 20 ± 2 ) g,购自厦门大学实验 动物中心。25  35 和 Aβ25  35 抗体均购自上?;忌锟萍加邢薰?span>。即用型**组化超敏 SP 试剂盒和 DAB 显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。DB001 型 Morris 水迷宫购自北京智鼠多宝生物科技有限责任公司。CCD 显微成像系统购自美国 Pixera。

1 2 方法

1 2 1    动物分组及给药    实验小鼠 60 只适应性饲 1 周,按体质量分层后随机分为6 组( 每组10 只) : 正常对照组、假手术组、AD  模型组、蜂毒明肽低剂量组、蜂毒明肽中剂量组、蜂毒明肽高剂量组。正常对 照组小鼠不做任何处理,假手术组小鼠侧脑室注射生 理盐水,蜂毒明肽组和 AD 模型组小鼠进行侧脑室注 4 μl 浓度为 1 mg / ml 25  35 溶液构建 AD 动物模型。14 d 后, 10 ml / kg 的剂量,分别给蜂毒明肽低、、高剂量组小鼠腹腔注射浓度为 0 006、0 02、

0. 04 mg / ml 的蜂毒明肽溶液,其余组注射等体积的生理盐水,连续 5 d。

2 2     Morris 水迷宫法测定小鼠认知功能     造模 14 d后,每次腹腔注射蜂毒明肽 30 min 后进行水迷宫测试,平台置于第Ⅳ象限距离池壁 35 cm 处,水面高出玻璃平台约 2  cm,水温控制在( 20 ± 2) ℃ 。测试前1 d将让小鼠熟悉水池环境,先将小鼠放入水池中让其自由游泳 2  min,随后引导其至玻璃平台停留 10 s。( 1) 定位航行实验: 将小鼠随机从不同的象限置入池内,小鼠到达玻璃平台上 5 s 后终止记录,果小鼠 60 s 内仍然不能找到玻璃平台,则将其引导到玻璃平台上停留 5 s。每次测试四个象限,每一象限测试间隔 10 min。记录逃避潜伏期,即小鼠找到玻璃平台的时间,连续测试 4 d。( 2) 空间探索实验: 第5 d 时撤掉玻璃平台,随机定位一个入水点,使得所有待测试小鼠均在该点进入水槽,记录 60 s 内小鼠在原目的象限内停留时间和穿环次数即小鼠游经原放置玻璃平台位置的次数。

1 2 3 **组化 Morris 水迷宫实验结束后,小鼠快速断头,取大脑,将脑组织在 4% 多聚甲醛磷酸盐溶液中固定 24 h。于人字点前 3mm 处冠状面取材。石蜡包埋后切片( 4 μm) ,常规脱蜡至水,微波修复抗原,SP  法**组化染色,DAB  显色,苏木素复染。 PBS 代替一抗做阴性对照。蛋白表达阳性部位呈有别于背景的棕黄色,判定为阳性。显微图像分析系统 分析并测定相对灰度值。

1. 3 统计学分析 采用 SPSS 16 0 统计软件对实验

数据进行分析。计量资料用 x珋± s 表示,组间比较采用 One-way  ANOVA,两两比较方差齐时用 LSD-t 检验,方差不齐时用 Games-Howell 检验。P  0 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组小鼠认知功能变化  Morris 水迷宫实验检测的各组小鼠认知功能变化结果见表 1、 2。与正常对照组比较,蜂毒明肽各组和 AD 模型组小鼠的平均逃避潜伏期时间增长、目的象限停留时间减短、穿环次数有所减少( P 均  0 05) 。而假手术组小鼠的各项指标与正常对照组比较无统计学差异( P 

0. 05) 。 AD 模型组相比较,蜂毒明肽各剂量组小

鼠的平均逃避潜伏期有所缩短,目的象限停留时间有所延长,穿环次数有所增加,其中蜂毒明肽中剂量组和高剂量组变化明显( P 均  0 05) 。

2 2    各组小鼠海马 CA1 区 Aβ25  35 的表达    Aβ25  35

在脑组织神经元中的表达主要定位于胞膜和胞质中, 呈有别于背景的棕黄色。**组化结果显示,正常对  照组与假手术组有少数淡黄色阳性染色颗粒,阳性表  达不明显; 蜂毒明肽各组和 AD 模型组镜下可见棕黄色强阳性染色颗粒。 AD 模型组比较,蜂毒明肽各25  35 的表达较弱。见图 1。平均灰度值分析显示,与正常对照组相比,蜂毒明肽组和 AD 模型组Aβ25  35 表达有所增加( P 05 ) ,而假手术组未见差异( P  0 05) 。与 AD 模型组相比,蜂毒明肽各组小鼠海马 CA1 25  35 的表达减少,其中蜂毒明肽中、高剂量组变化较明显( P 均  0 05) 。见图 2。




3 讨论

AD 作为一种危害老年人身体健康的神经系统**,给社会与患者家庭带来沉重负担。由于 AD 起病隐秘,病因复杂,到目前为止,临床上尚缺乏有效的防治 AD 方法和**。Aβ 过度表达和沉积已被公认为是 AD 发生、发展的主要原因 3]。因此,如何减少Aβ 过度表达已经成为防治 AD 研究的热点之一。蜂毒明肽作为蜂毒中重要的多肽之一,约占蜂毒干质重 1% 2% ,被认为是一种很强的神经**,其可以通过血脑屏障,直接作用于**神经系统4 5]。张爱提等6]对中华蜜蜂蜂毒明肽基因序列进行了生物信息学分析,发现其存在较明显的跨膜区结构和信号肽序列,具有生物**肽的特性。同时,研究发现蜂毒明肽可以通过调节机体内肾上腺素或者改变细胞膜上的离子通道继而提高认知功能 2,但其对公认的 AD 模型动物干预作用国内报道还很少见。

       本研究结果显示,与正常对照组相比,AD 模型组小鼠的逃避潜伏期时间延长,在目标象限停留时间减少,穿越平台的次数减少,海马 CA1 区Aβ25  35 表达增多。而采用蜂毒明肽干预的各组小鼠较 AD 模型组小鼠逃避潜伏期有所缩短,在目标象限停留时间有所延长,穿环次数增多,海马 CA1 区Aβ25  35 阳性表达减弱。说明蜂毒明肽能减少海马CA1 区Aβ25  35 的表达,继而提高 AD 小鼠认知功能,改善 AD 病程,其分子机制可能与其特异性阻断小电导钙激活性钾通道有关7]。

 

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